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F. Rudroff:
"Design and Application of non native enzyme cascades in living cell factories";
Bericht für FWF; Berichts-Nr. 2, 2014; 1 S.

In diesem Projekt behandeln wir die Herstellung von Zucker und Azazuckerderivaten, die sowohl als Medikamente sowie als wertvolle Grundbausteine für weitere Feinchemikalien Verwendung finden. Dabei werden einfache, als Acetylestergeschützte primäre Alkohole als Ausgangsmaterial verwendet. Diese werden dann in weiterer Folge in der Zelle hydrolysiert und im Anschluss zu den sehr reaktiven Aldehyden oxidiert. Danach findet eine Aldolreaktion mit dem wirtseigenen Metaboliten Dihydroxyaceton statt, und resultiert in dem noch phosphorylierten Produkt. Damit ein Transport dieser relativ polaren Verbindung aus der Zelle erleichtert wird soll nun noch ein Dephosphorylierungsschritt angehängt werden.
Die Arbeiten in diesem Projekt sind auf 3 Bereiche aufgeteilt. Zum einen wurden im letzten Jahr sämtliche Ausgangsmaterialien (10 geschützte Alkohole), dazugehörige Intermediate (10 prim. Alkohole, 7 Aldehyde), potentielle Nebenprodukte (7 Säuren - Überoxidationsprodukt) hergestellt und mittels umfassender Analytik charakterisiert. Anschließend wurden HPLC und GC Methoden entwickelt um ein schnelles testen der biokatalytischen Performance unserer Zellfabriken zu ermöglichen. Die Variabilität der Verbindungen reicht hier von sehr einfach bis hochgradig komplex, und hat ein hohes Maß an synthetischem Arbeitsaufwand und organisch-chemischen Grundverständnisses gefordert. Der nächste Meilenstein ist die Herstellung der Endprodukte und der letzten Intermediate, welches für das nächste halbe Jahr avisiert ist.
Der zweite Bereich liegt in der Zugänglichkeit der geeigneten Biokatalysatoren im Wirtsorganismus E.coli. Dabei wurden 3 unterschiedliche Esterasen für den ersten Schritt der Kaskade erfolgreich in E.coli exprimiert und an den gewünschten Substraten erfolgreich getestet. Für die nachfolgende Oxidation wurden mehrere unterschiedliche Alkoholdehydrogenasen getestet (LK-ADH, RR-ADH, HLADH). Hier konnten zwar alle Enzyme erfolgreich hergestellt und in ausreichender Menge und Aktivität produziert werden, jedoch wurden nur einzelne Substrate umgesetzt. Aus diesem Grund wurden 2 weitere synthetische Gene bestellt, die dann ebenfalls in E.coli kloniert werden sollen und basierend auf vorhandene Literaturdaten unsere gewünschten Substrate umsetzen sollten.
Für den anschließenden Aldol-Schritt wurden 4 verschiedene Aldolasen in E.coli exprimiert, die es uns ermöglichen sollte, Zugang zu unterschiedlichen Stereoisomeren zu bekommen. Die Aktivität der Enzyme am Modelsubstrat war erfolgreich, und an der Optimierung der Reaktion für die präparative Anwendung wird im Folgenden gearbeitet. Um den letzten Schritt zu etablieren wurde eine sehr universell einsetzbare Phosphatase in E.coli exprimiert. Dabei stehen wir immer noch vor dem Problem, dass wir sowohl Löslichkeitsprobleme als auch Expressionsprobleme haben. Ein Ansatz hier liegt in der Lokalisierung des Enzymes, welches im Moment noch im Periplasma liegt. Durch geeignete Signalsequenzen wollen wir das Enzyme im Cytoplasma halten und somit eventuell die Löslichkeit und damit auch die Aktivität zu erhöhen.
Der dritte Bereich hat sich im letzten Jahr mit der Etablierung der Flussanalyse und den notwendigen systembioloigschen Methoden beschäftigt, die für eine anschließende Optimierung der Enzymkaskade von Bedeutung sind. GC-MS und LC-MS/MS Methoen für die Bestimmung von Stoffflüssen und intrazellulären Metaboliten. Dabei wurden sowohl die COBRA-Toolbox (FBA Software) mit Omix (Visualisierungs-Software) kombiniert um modellierte Daten mit gemessenen vergleichen und darstellen zu können. Des Weiteren wurde die artifizielle Enzymkaskade an das E.coli Netzwerk angeschlossen und die ersten Simulationen, bezüglich Zellwachstum und unterschiedlichen Flüssen wurden durchgeführt. Zusätzlich sind die ersten Arbeiten für die Erstellung eines kinetischen Modells (Isolation und Aufreinigung aller erforderlichen Enzyme, kinetische Messungen der Einzelreaktionen) durchgeführt worden.