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D. Ret:
"Chemical and physical characterization of native and modified hyaluronan";
Betreuer/in(nen), Begutachter/in(nen): S. Knaus, H. Peterlik, E. Srebotnik; Institut für Angewandte Synthesechemie, 2017; Rigorosum: 07.12.2017.

Der Zweck der vorliegenden Studie war einerseits eine umfassende Charakterisierung von hoch-molekularem Hyaluronan in Lösung und andererseits die Herstellung von Derivaten mit definierte durchschnittlichen Substitutiongraden (DS). Über eine Kontrolle der Polymerkonformation im Lösung vor der Derivatisierung sollte eine Steuerung und Reproduzierbarkeit des DS möglich sein. Die Kontrolle des DS ist entscheidend, um hochwertige Produkte mit präzisen mechanischen Eigenschaften zu bekommen.
Die Konformation von Hyaluronsäure in wässrige Lösungen wurde mittels Gel-permeations chromatographie, Viskosimetrie und Lichtstreuung bei verschiedenen Konzentrationen und Ionenstärken untersucht. Bei neutralem pH und niedriger Ionenstärke hat HA eine gestreckte Konformation und das größte Volumen, da sich die negativen Ladungen abstoßen.
Die progressive Erhöhung der Ionenstärke verringert das Volumen des Polymers, da die Abstoßungskraft verringert wird.
Durch Ansäuern von HA entsteht die freie Hyaluronsäure (HAH). Im dieser Form sind die Säuregruppen in Wasser kaum dissoziiert und es würde eine hohe Aggregationstendenz festgestellt.
HAH ist in DMSO nicht löslich. Für eine vollständige Lösung müssen ausreichende DMSO-kompatiblen Aminen und Salzen zugegeben werden. So können klare homogene Lösung in DMSO erhalten werden.
Die chemische Charakterisierung mit NMR Spektroskopie liefert nur dann präzise Ergebnisse, wenn volle Protonenmobilität vorliegt. Die Protonenbeweglichkeit hängt von der Konzentration des Polymeren in Lösung, dem Gyrationradius und dem hydrodynamischen Radius von Hyaluronan in Lösung ab. Durch Zugabe von Lauge, Salzen oder durch enzymatische Behandlung ist eine quantitative Analyse von HA-Derivaten möglich.
Nachteile einer Modifizierung von HA in DMSO sind Löslichkeitprobleme, sehr lange Reaktionszeiten und ein sehr niedriges Molekulargewicht im Vergleich zum nativen Produkt.
Diesen Problemen können durch Modifizierung im Wasser mit DMTMM als Aktivierungsreagenz gelöst werden. Die Anzahl den Reaktionsschritte wurde reduziert, das Molekulargewicht konnte gehalten und der durchschnittliche Substitutionsgrad kontrolliert werden.

The purpose of the present study was to characterize the properties and behavior of high molecular weight hyaluronan in solution prior to derivatization. Achieving a control of the polymer conformation during the modification control and reproducibility of the degree of substitution (DS). Both parameters are very important in industrial production, because the mechanical properties of the derivatives strongly depend on DS.
First the molecular weight and conformation of hyaluronic acid sodium salt (HA) was studied by SEC, viscosimetry and LS analysis in aqueous solutions. Changing the polymer concentration and ionic strength dramatically influences the conformation in solution. At low concentration, neutral pH and at low ionic strength HA occupies the largest volume and assumes a rigid conformation. Progressive increasing of the ionic strength reduces the volume of the polymer by shielding the negative charges and compressing the polymer chains.
Conversion of HA into the acid form (HAH) yields a low dissociated polycarboxylic acid. In water this polymer shows high tendency to aggregation compared to the dissociated polyelectrolyte HA. To dissolve HAH in DMSO it has to be transformed into salts by addition of amines and sufficient amount of DMSO compatible salts. This way clear homogeneous DMSO solutions are obtained.
Chemical characterization with NMR spectroscopy gives accurate result only in the case of full proton mobility. Proton mobility strongly depends on the concentration of the solution and the chain overlap point (Rg or Rh). Reducing Rh of HA by addition of base, salt or enzymatic treatment allows quantitative analysis of HA.
Modification of HA in DMSO suffers from low solubility of HA in DMSO, poor controllability of DS, long reaction times and very low Mw compared to the native product. The low reproducibility was associated to an inhomogeneous dissolution of HAH in DMSO. All these problems could be overcome by modification of HA in water with the use of the activating reagent DMTMM.

properties and behavior of high molecular weight hyaluronan, control of the polymer conformation during the modification control and reproducibility of the degree of substitution, industrial production, mechanical properties of the derivatives