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J. Jodlbauer, F. Rudroff, M.D. Mihovilovic:
"A RBS library in cyanobacteria to boost biocatalytic activity";
Poster: Biotrans 2021, Graz; 19.07.2021 - 22.07.2021.

Cyanobakterien sind vielversprechende und im wahrsten Sinne des Wortes die "grünsten" Kandidaten für mikrobielle Biokatalysatoren. Diese Bakterien bieten ein nachhaltiges Produktionssystem, da sie Wasser, Kohlendioxid und Sonnenlicht als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen. Da wir uns für Redox-Enzyme als Katalysatoren interessieren, bietet ihnen ihr photoautotropher Stoffwechsel einzigartige Vorteile. Während der Photosynthese (i) produzieren sie große Mengen des energiereichen Cofaktors NADPH, der direkt zum Antrieb enzymatischer Reaktionen verwendet werden kann. Zweitens wird (ii) Sauerstoff als Nebenprodukt produziert, das für sauerstoffgetriebene Reaktionen genutzt werden kann. Trotz dieser großen Vorteile für die Biokatalyse sind die Fortschritte in diesem Forschungsbereich durch die verbleibenden Herausforderungen begrenzt. Einerseits besteht eine große Herausforderung darin, ausreichende Expressionsraten rekombinant exprimierter Gene im Cyanobakterium zu erreichen. Andererseits sind Screenings mit hohem Durchsatz durch die speziellen Cyanobakterien-Kultivierungsbedingungen begrenzt.
Auf der Grundlage dieser großen Einschränkungen haben wir eine Strategie entwickelt, die darauf abzielt, beide Engpässe zu überwinden. Zunächst haben wir (i) eine RBS-Library zusammen mit einer Klonierungsstrategie aufgebaut, die mit dem CyanoGate-Klonierungskit kompatibel ist und eine schnelle und einfache Zusammenstellung einer plasmidbasierten Expressionsbibliothek für ein spezifisches Gen ermöglicht. Um ein High-Throughput-Screening (ii) zu ermöglichen, fusionieren wir GFP C-terminal an unsere GOIs. Dies ermöglicht ein Hochdurchsatz-Screening auf verschiedene Expressionsniveaus. Mit dieser Strategie wollen wir Biotransformationen in den Cyanobakterienstämmen Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus elongatus UTEX 2973 durchführen und verbessern. Als Enzyme untersuchen wir eine Alkoholdehydrogenase (RR-ADH), eine Ketoreduktase (LfSDR1M50), eine Enoatreduktase (YqjM) und eine Baeyer-Villiger-Monooxygenase (CHMOAcineto). Durch den Vergleich der biokatalytischen Aktivität verschiedener Expressionsstämme wollen wir hochleistungsfähige cyanobakterielle Ganzzell-Biokatalysatoren finden.

Übersetzt mit www.DeepL.com/Translator (kostenlose Version)

Cyanobacteria are promising and, quite literally, the "greenest" candidates for microbial biocatalysts. These bacteria offer a truly sustainable production system by using water, carbon dioxide and sunlight as their source of carbon and energy. With our interest in redox-enzymes as catalysts, their photoautotrophic metabolism equips them with unique advantages. During photosynthesis (i) they produce high amounts of high-energy cofactor NADPH, which can be used directly to drive enzymatic reactions. Secondly, (ii) oxygen is produced as by-product, which can feed oxygen-driven reactions. Despite these great advantages for biocatalysis, progress within this research field is limited by the remaining challenges. On the one hand, one big challenge is still to obtain sufficient expression levels of recombinantly expressed genes within the cyanobacterial host. On the other hand, high throughput screenings are limited by the special cyanobacterial cultivation conditions.
Based on these major limitations, we developed a strategy, which aims to tackle both bottlenecks. First, (i) we built a RBS library together with a cloning approach, compatible with the CyanoGate cloning kit, that allows a fast and simple assembly of a plasmid-based expression library of a specific gene of interest (GOI). To enable high throughput screening (ii), we fuse GFP C-terminally to our GOIs. This enables high throughput screening for diverse expression levels. Applying this strategy, we aim to realize and improve biotransformations in the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechococcus elongatus UTEX 2973. As enzymes, we investigate an alcohol dehydrogenase (RR-ADH), a ketoreductase (LfSDR1M50), an enoate reductase (YqjM), and a Baeyer-Villiger monooxygenase (CHMOAcineto). By comparing the biocatalytic activity of different expression strains, we aim to find high performing cyanobacterial whole-cell biocatalysts.

Cyanobacteria, Biocatalysis, Biotransformation

https://publik.tuwien.ac.at/files/publik_300371.pdf